发布日期：2024-10-06 14:13 点击次数：128
叶绿体是绿色植物独到的细胞器，算作光融合用的主要处所，为植株助长发育提供能量，在绿色植物的几个进军生化流程和光融合用中施展着弗成或缺的作用[1]。高档植物叶绿体基因组的结构绝顶保守，大多数基因组为双链环形DNA分子，其结构由4个部分组成，分别是大单拷贝区(large single-copy region， LSC)、小单拷贝区(small single-copy region， SSC)和一双反向重迭区(inverted repeat， IRs)[2]。叶绿体基因组是从母本遗传下来的，在基因含量和基因组结构上高度保守，大多数叶绿体基因组的长度在120–160 kb之间，含有110–130个单拷贝的基因[3]。叶绿体基因组的琢磨早期主要用于琢磨特等濒危植物的进化历史和保护，现在已等闲应用于各物种遗传各类性、系统进化等的琢磨[4]。跟着高通量测序时间的继续完善男同 性愛，自初度赢得香烟[5]叶绿体基因组序列信息，现在已有大花正人兰[6]、苦瓜[7]、山核桃[8]、安息香猕猴桃[9]等多栽种物的叶绿体基因组完成测序，剖释了叶绿体基因组特征和重迭序列等，细目了系统位置偏激与近缘物种的亲缘关系。
空腹泡(Rubus rosaefolius Sm)笔名蔷薇莓，属于蔷薇科悬钩子属，在环球等闲逸播。该物种原产于所罗门群岛、新喀里多尼亚、瓦努阿图、毛里求斯、中南半岛和中国[10]。空腹泡开白花和结红色果实，果实4–5月练习，养分丰富，口感香甜，入药可治肺热咳嗽、冷汗、跌打毁伤等[11]，在传统医学顶用于调整泻肚和胃部疾病[12]，具有镇痛、抗菌、降压等药感性情[10]。琢磨标明，空腹泡还具有降血压[13]、抗氧化[14]、抗癌[15]等功能。此外，算作新式生果，空腹泡富含红色素，该色素属水溶性花青苷类色素，有较好的光和热融会性，适用pH值限制宽，适于用作自然食用着色剂，且可通过调治pH赢得不同光辉[16]。因此，空腹泡的遗传和基因组信息对于系统琢磨和野生资源保护具有进军意念念。
空腹泡算作第3代新式生果，是一种优良的野生果树资源，具有强大潜在设备价值。然则现在对于空腹泡的琢磨主要蚁合在养分因素的提真金不怕火[11]和药感性情[10]，而对于空腹泡叶绿体基因组的系统琢磨尚鲜见报谈。本琢磨以空腹泡为材料，通过高通量测序、拼装和基因安逸，赢得空腹泡叶绿体全基因组，并完成叶绿体基因组系统发育分析，以此升迁对悬钩子属叶绿体基因组结构的了解，为今后悬钩子属植物的遗传各类性和系统发育分析提供参考。
1 材料与才智 1.1 考研材料2021年10月空腹泡植物样本采样于贵州省植物园(26°37′20′′N，106°43′29′′E)。取崭新叶片用液氮处置，于贵州大学农学院园艺本科教学现实室−80 ℃超低温雪柜中保存待用。
1.2 才智 1.2.1 空腹泡DNA提真金不怕火和测序继承十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide， CTAB)法[17]从300 mg崭新叶片中提真金不怕火基因组DNA，提真金不怕火的基因组DNA经检测及格后，用超声波法将DNA片断化；对片断化的DNA进行片断纯化、结尾配置、3′端加A、勾通测序接头，再用琼脂糖凝胶电泳进行片断大小遴荐，进行团员酶链式反应(polymerase chain reaction， PCR)扩增变成测引言库，并对文库进行质检，质检及格的文库用Illumina NovaSeq进行测序(深圳市惠通生物科技有限公司)。原始数据经往常接头沾污，去除低质料序列后得到3.82 G的干净数据(clean reads)。
1.2.2 空腹泡叶绿体基因组的拼装和安逸原始测序数据使用NGS QC Tool Kit v2.3.3[18]进行质控，使用de novo拼装软件SPAdes v3.11.0，从3.82 G的高质料数据中拼装出完好的叶绿体基因组[19]。使用PGA软件对完好的叶绿体基因组进行安逸[20]。将最终得到的基因组安逸信息以及基因组序列提交至GenBank (登录号为OL435124.1)。临了使用OGDRAW软件[21]制作空腹泡叶绿体基因组完好图谱。
1.2.3 空腹泡叶绿体密码子偏好性和重迭序列分析期骗CodonW软件[22]统计分析空腹泡叶绿体基因组密码子的偏好性(relative synonymous codon usage， RSCU)。利用Reputer软件[23]展望空腹泡草叶绿体基因组散在重迭序列。即正向重迭(forward， F)、反向重迭(reverse， R)、互补重迭(complement， C)、回环重迭(palindromic， P)，最小重迭长度(minimal repeat size)缔造为30，最小胪列值(minimum alignment score)为50，最多碱基错配(hamming distance)为3。利用MISA软件[24]检测空腹泡叶绿体基因组的简便重迭序列(simple sequence repeat， SSR)位点，单核苷酸(mononucleotide)、二核苷酸(dinucleotide)、三核苷酸(trinucleotide)、四核苷酸(tetranucleotide)、五核苷酸(pentanucleotide)和六核苷酸(hexanucleotide)的最小重迭值分别缔造为10、5、4、3、3和3。
jav巨乳 1.2.4 IR区范围平纵情膨大分析期骗IRscope软件[25]对空腹泡和同属的腺萼悬钩子(Rubus glandulosopunctatus， NC_ 057624.1)、能高悬钩子(Rubus rubroangustifolius， NC_057629.1)、小叶悬钩子(Rubus taiwanicola， NC_056940.1)、光滑悬钩子(Rubus tsangii， NC_056940.1) 4个物种进行叶绿体基因组范围平缓与膨大比较分析，绘图对比图。
1.2.5 空腹泡叶绿体基因组系统发育树的构建从NCBI中下载蔷薇科34个物种的叶绿体基因组序列，以刺蔷薇[Rosa acicularis (MK714016.1)]算作外群进行系统进化分析。利用MAFFT 7.037软件[26]对35种蔷薇科植物进行多重比对。随后，使用model-finder var 1.6来遴荐TVM+F+I+G4模子[27]。临了，利用RAxML var 8.2.9软件[28]构建系统发育树。自举检测值为1 000。
2 遵守与分析 2.1 空腹泡叶绿体全基因组基本特征分析空腹泡叶绿体全基因组(GenBank登录号：OL435124)由155 650 bp核苷酸组成(图 1)，具有典型的四分体结构特征，即1个大单拷贝区(LSC)、1个小单拷贝区(SSC)和1对反向重迭序列(IRs)。
LSC区长度为85 443 bp，SSC长度为18 711 bp，两个反向重迭序列长度为25 748 bp，全基因组的GC含量为36.9%。空腹泡叶绿体基因组安逸遵守深刻，空腹泡叶绿体基因组编码131个基因，包括86个卵白质编码基因、37个tRNA基因和8个rRNA基因(表 1)。其中5个卵白编码基因(protein coding genes， PCGs) (rpl2、rpl23、ycf2、ndhB和rps7)，4个rRNA基因(rrn16、rrn23、rrn4.5和rrn5)，7个tRNA基因(trnA-UGC、trnI-CAU、trnI-GAU、trnL-CAA、trnN-GUU、trnR-ACG和trnV-GAC)在IR区域复制，ycf1基因位于两个IR区和SSC区接壤处。
编码基因证据其家具功能的不同可分为光融合用联系基因(44)、自我复制联系基因(59)、其他(6)、未知功能基因(4)。其中，大多数基因不具有内含子，独一petB、ndhA、rpl2、rps16等14个基因含有1个内含子，clpP和ycf3含有2个内含子。此外，基因rps12存在反式剪接(表 2)。
2.2 空腹泡叶绿体基因组重迭序列分析空腹泡叶绿体基因组中共断然出47个散在重迭序列，其中有25个正向重迭(53.19%)，3个反向重迭(6.38%)，2个互补重迭(4.26%)和17个回环重迭(36.17%)。除了一个回环重迭序列较长外(25 748 bp)，其余重迭序列均在30–56 bp。各重迭序列在基因编码区(ndhA、clpP、rpl16等)、基因间隔区(trnS-GCU-trnG-UCC、trnV-GAC-rps7、rrn4.5-rrn5等)、tRNA (trnG-UCC、trnS-GGA、trnG-GCC)和ycf3、clpP基因内含子区域均有散播(表 3)。
2.3 空腹泡叶绿体基因组SSR分析空腹泡叶绿体基因组断然出6种不同序列的72个SSR位点，包含单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸，莫得出现四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸(表 4)。其中，单核苷酸重迭数目最多，共58个，占80.56%，主要以A/T重迭序列为主，共55个，C/G重迭类型仅为3个；二核苷酸重迭数目为11个，包括AG/CT (1SSR)和AT/AT (10SSR)两种重迭序列，占15.28%；三核苷酸重迭数目仅为3个，具有AAG/CTT (1SSR)和AAT/ATT (2SSR)两种重迭形势，占4.17%。
2.4 空腹泡密码子偏好性分析密码子使用情况深刻，空腹泡叶绿体基因组除拒绝密码子外，共有48 957个密码子，共有22种氨基酸被这些密码子编码，各式氨基酸的使用频率在1.30%–10.10%之间(表 5)。空腹泡叶绿体基因组密码子数目最多的氨基酸是亮氨酸(Leu)，具有5 239个密码子，占10.10%，其次是异亮氨酸(Ile)和丝氨酸(Ser)，分别具有4 501个和3 732个密码子，占总密码子数的8.68%和7.19%，数目最少的氨基酸是色氨酸(Trp)，具有677个密码子，占1.30%。同义密码子使用频率(relative synonymous codon usage， RSCU) > 1的密码子有32个，其中28个密码子以A/U终结，独一4个以C/G终结，证明空腹泡叶绿体基因组偏好使用A/U终结的密码子。
2.5 IR区平缓与膨大分析将空腹泡叶绿体基因组的IR-LSC和IR-SSC范围与已报谈的4个悬钩子属物种进行比较，图 2深刻，5个物种的LSC/IRb范围均位于rps19和rpl2之间，空腹泡rps19基因距离LSC/IRb范围25 bp，光滑悬钩子距离范围16 bp，其余3个物种均距离范围24 bp。除了光滑悬钩子外，其余4个物种的IRb/SSR范围均存在完好的ycf1基因；其中腺萼悬钩子ycf1基因位于IRb区部分的长度为1 092 bp，而小叶悬钩子、能高悬钩子和空腹泡ycf1基因位于IRb区部分的长度均为1 215 bp；ycf1基因参预SSC区的长度从14 bp到26 bp，其中小叶悬钩子和能高悬钩子ycf1膨大最大。5个物种在IRb/SSC范围的SSC一侧均存在完好的ndhF基因，且均距离IRb/SSC范围16 bp的长度。5个物种在SSC/IRa范围存在完好的ycf1基因，光滑悬钩子的ycf1基因长度为5 036 bp，空腹泡ycf1基因长度为5 705 bp，其余3个物种的ycf1基因长度均为5 819 bp。5个物种在IRa区均存在trnN基因。5个物种在IRa/LSC范围的LSC一侧均存在trnH基因和psbA基因，光滑悬钩子的trnN基因刚好与范围皆平，空腹泡trnN基因距离范围2 bp，其余3个物种均距离范围1 bp。
2.6 系统进化分析以空腹泡、33个悬钩子属植株和刺蔷薇(算作外群)的叶绿体基因组构建最大似然(maximum likelihood， ML)系统发育树，以获取空腹泡与它们的关系。遵守深刻，能高悬钩子(Rubus rubroangustifolius)和腺萼悬钩子(Rubus glandulosopunctatus)先聚为一支，再与小叶悬钩子(Rubus taiwanicola)聚为一支，这3个物种组成的分支与空腹泡聚为一支，自展相沿率大于90%，遵守真确度高，证明空腹泡与小叶悬钩子亲缘关系最近，其次是能高悬钩子和腺萼悬钩子(图 3)。
3 琢磨悬钩子属植物具有高度可变的方式，复杂的无交融生殖、多倍体和杂交等情况，是吐花植物中最难分类的类群之一[29]。徐玉芬[30]在悬钩子属植物叶绿体基因组的琢磨中发现，悬钩子属植物叶绿体基因组大小为155 464–156 506 bp，能编码126–135个基因，总GC含量为36.9%–37.3%。本琢磨拼装的空腹泡叶绿体基因组全序列长度为155 650 bp，安逸了131个基因，GC含量为36.9%。这与高粱泡[31]、牛叠肚[32]、多腺悬钩子[33]等悬钩子属植物的叶绿体基因组结构特征肖似，标明悬钩子属植物叶绿体基因组大小、基因组成等高度保守。在亲缘关系较近的蓬虆[34]中发现，其叶绿体基因组(156 380 bp)和总GC含量(37.0%)均大于空腹泡，再结合方式(空腹泡叶子较蓬虆细，且多以5到7叶为主，蓬虆3叶到5叶为主)、地域散播(空腹泡主要散播于江西、湖南、四川、贵州等地，蓬虆主要散播于河南、江西、浙江、江苏等地)，将二者初步差别，但由于悬钩子属近源物种之间易杂交产生新品种，使其分类及系统发育关系的厘清职责十分贫窭。
IR区、LSC区和SSC区的膨大和平缓会引起叶绿体基因组大小出现各异，是物种进化流程中常见的欢畅[35]。本次琢磨通过比较5个悬钩子属植物IR区范围近邻的基因位置和长度(rps19、rpl2、ndhF、ycf1和trnH)，来推崇基因的平缓与膨大。遵守深刻，5个悬钩子属植物叶绿体基因组的LSC/IR和SSC/IR范围高度相通，5个物种LSC/IRb范围均位于rps19和rpl2之间，在IRb/SSC范围的SSC一侧均存在完好的ndhF基因，且距离IRb/SSC范围的长度交流，在SSC/IRa范围均存在完好的ycf1基因，这与Yu等[29]的琢磨遵守一致，证明悬钩子属物种IR区与LSC和SSC区的范围保守性较高。此外，空腹泡在LSC/IRb范围的rps19基因及SSC/IRa范围的ycf1基因均存在平缓欢畅，在IRa/LSC范围的trnH基因存在膨大欢畅，其基因平纵情膨大的原因可能是IR范围变化引起[30]。因此，尽管悬钩子物种的叶绿体基因组结构和基因排序较为保守，但IR范围仍存在的平缓膨大变化，标明悬钩子属叶绿体基因组中基因与其排序的保守性和IR范围平缓膨大的各类性并存。
重迭序列在叶绿体基因组中施展着进军的进化作用，能促进叶绿体基因组重排，影响基因组结构的变化，而况不错增多种群遗传各类性[36]。空腹泡叶绿体基因组中共含有47个散在重迭序列，其中正向重迭和回环重迭为主要重迭序列，占比接近90%，大多数重迭序列散播在基因间隔区和内含子序列中。重迭序列散播欢畅与豆瓣菜叶绿体基因组[37]的琢磨遵守一致。简便重迭序列是叶绿体基因组中一段长度为1–6 bp的重迭序列，具有共显性、多等位基因、高度可变、多态性等性情，是琢磨遗传变异性的最好象征[38-39]。本琢磨遵守深刻，空腹泡叶绿体基因组共检测出72个SSR位点，占比最大的是单核苷酸(80.56%)，其中含有丰富的AT碱基，而多聚的A或T为最多的类型，这种欢畅在桃属[40]、山楂属[41]等中也有报谈，进一步阐明了被子植物的SSR主如果由短的poly A和poly T组成。与同属的插田泡(44SSR)、光滑高粱泡(54SSR)和黑莓‘阿拉好’(40SSR)叶绿体基因组比较，本琢磨发现空腹泡所含SSR位点大于这3个物种，且碱基类型更为丰富，空腹泡包含单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸三种类型，而插田泡、光滑高粱泡和黑莓‘阿拉好’均只含2种碱基类型[42]。空腹泡重迭序列的获取，为悬钩子属植物的进一步的演化琢磨提供参考。
密码子偏好性是浩繁存在于生物体内基因组中一个进军的进化特征，对于基因抒发和生物体进化具有进军意念念[43]。同义密码子使用频率(RSCU)不祥直不雅反应出密码子使用的偏好性，当密码子的RSCU > 1时，标明该密码子使用频率较高，当密码子的RSCU=1时，标明该密码子莫得偏好性，RSCU < 1标明该密码子使用频率比其他同义密码子低[44]。本琢磨发现，高频密码子有32个，其中87.5%的密码子第3位碱基为A/U，证明空腹泡叶绿体基因组具有偏好性，偏好使用A/U终结的密码子。在同属的高粱泡[31]琢磨中发现，RSCU > 1的密码子有33个，其中，28个密码子的第3位碱基为A/U，4个以C/G终结。本琢磨中RSCU > 1的密码子虽比高粱泡少，但其密码子偏好性与高粱泡一致。
叶绿体联系基因的抒发虽受到核基因的调控，但其基因组含有多量的遗传信息，且叶绿体基因组一般枯竭重组、核苷酸替换率低以及常常为单亲遗传，因此在物种断然和系统发育等琢磨中施展着进军的作用[45-46]。系统发育分析标明，空腹泡与小叶悬钩子关系最为密切，其次是能高悬钩子和腺萼悬钩子。
4 论断本琢磨继承高通量测序时间，对空腹泡叶绿体进行测序，赢得完好的叶绿体基因组序列。空腹泡的完好叶绿体基因组总长度为155 650 bp，具有典型的四分体结构，包括2个反向重迭序列(IRs各25 748 bp)、1个大拷贝区(85 443 bp)、1个小拷贝区(18 711 bp)；共断然出131个基因，包括86个卵白质编码基因、37个tRNA基因和8个rRNA基因，全基因组的GC含量为36.9%；共断然了47个散在重迭序列，以正向重迭和回环重迭为主，主要散播在基因间隔区和内含子序列；包含72个SSR位点，其中单核苷酸58个，二核苷酸11个、三核苷酸3个；密码子使用率最高的是亮氨酸男同 性愛，使用率最低的是色氨酸，偏好使用A/U终结的密码子。空腹泡与同属植物中小叶悬钩子、能高悬钩子和腺萼悬钩子亲缘关系最近。空腹泡叶绿体基因组的剖释，细目了空腹泡在悬钩子属的系统位置和系统发育关系，为今后悬钩子属植物系统发育分析提供表面依据。
